C - Chemistry – Metallurgy – 12 – N
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
N
C12N 9/22 (2006.01) A61K 38/46 (2006.01) A61K 48/00 (2006.01) C07H 21/00 (2006.01) C12N 15/10 (2006.01) C12N 15/11 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01) A61K 38/00 (2006.01)
Patent
CA 2117903
It has been discovered that any RNA can be targeted for cleavage by RNAase P from eukaryotic cells, for example, human HeLa cells, using a suitably designed oligoribonucleotide ("external guide sequence", or EGS) to form a hybrid with the target RNA, thereby creating a substrate for cleavage by RNAase P in vitro. There are two classes of EGS that can target RNA for cleavage human RNAase P. These are prepared by transcription from a small DNA fragment that contains a sequence coding for an RNA that can assume a tRNA-like secondary structure. In the first class, the structure lacks at least the first thirteen nucleotides from the 5' terminus of the tRNA-like sequence, the anticodon stem and loop, the variable loop or part of the variable loop. The most efficient EGS with human RNAase P is the EGS in which the anticodon stem and loop was deleted. In the second class, the EGS has changes in both the equivalent of the T-loop and the anticodon stem of the tRNA-like segment of the EGS. Methods are also disclosed to randomly select and to express a suitable EGS in vivo to make a selected RNA a target for cleavage by the host cell RNAase P, thus preventing expression of the function of the target RNA. The methods and compositions should be useful to prevent the expression of disease-causing genes in vivo.
La recherche a montré que tout ARN peut être ciblé pour clivage par RNase P des cellules eucaryotiques (des cellules humaines HeLa, par exemple), en employant un oligoribonucléotide («séquence externe de guidage», ou EGS) pour créer un hybride avec l'ARN ciblé, et d'ainsi créer un substrat pour le clivage par Rnase P in vitro. Deux classes de EGS peuvent cibler l'ARN pour le clivage par RNase P humain. Celles-ci sont préparées par la transcription d'un petit fragment d'ADN qui contient une séquence codant pour un ARN qui peut adopter similaire à une structure d'ARNt secondaire. La structure de la première classe manque au moins treize des premiers nucléotides de l'extrémité 5' de la séquence similaire à l'ARNt, la tige et boucle de l'anticodon, la boucle variable ou une partie de celle-ci. La EGS la plus efficace avec le RNase P humain est celui dont la tige et la boucle ont été supprimées. Les EGS de la deuxième classe comportent des modifications à l'équivalent de la boucle T et à la tige de l'anticodon du segment de la EGS similaire l'ARNt. En plus, des méthodes sont divulguées pour la sélection aléatoire et l'expression d'une EGS appropriée in vivo, dans le but de rendre un ARN ainsi choisi une cible pour clivage par la cellule hôte RNase, empêchant ainsi l'expression de la fonction de l'ARN ciblé. Les méthodes et les compositions devraient s'avérer utiles dans la prévention de l'expression des gènes responsables des maladies in vivo.
Altman Sidney
Guerrier-Takada Cecilia L.
Yuan Yan
Bereskin & Parr
Yale University
LandOfFree
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