C - Chemistry – Metallurgy – 12 – P
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
P
C12P 19/34 (2006.01) C12N 15/10 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01)
Patent
CA 2205563
This invention relates to a process for amplifying a specific nucleic acid sequence or its complement at a relatively constant temperature and without serial addition of reagents. The process provides in a single reaction medium an RNA polymerase, DNA polymerase, a ribonuclease that hydrolyses RNA of an RNA-DNA hybrid without hydrolysing single or double-stranded RNA or DNA, and ribonucleoside and deoxyribonucleoside triphosphates. The process then provides an RNA first template in the reaction medium. The RNA first template comprises a sequence complementary to a specific nucleic acid sequence, minus- sense sequences for a promoter and initiation site that are recognized by the RNA polymerase, and a 5'-terminal sequence that is complementary to at least the minus-sense sequence of the initiation site. Thus, the RNA first template has an inverted repeat sequence which could fold into a 5'-terminal stem-loop structure. The DNA polymerase uses the RNA first template to synthesize a DNA second template that together comprise an RNA-DNA hybrid. The DNA second template has plus-sense sequences of the promoter and the initiation site, and a 3'-terminal priming sequence that is complementary to the plus-sense sequence of the initiation site. The ribonuclease then hydrolyses an RNA which comprises the RNA-DNA hybrid, allowing the 3'-terminal priming sequence to hybridize to the plus-sense sequence of the initiation site in the DNA second template. The DNA polymerase then uses the DNA second template to synthesize the promoter by extending the 3'-terminal priming sequence of the DNA second template. The resulting partially double-stranded DNA has a promoter oriented toward the apex of a stem-loop structure. The RNA polymerase then recognizes the promoter and transcribes the DNA second template, thereby providing copies of the RNA first template. The process thereafter maintains the reaction conditions for a time sufficient to achieve a desired amplification of the specific nucleic acid sequence or its complement. This invention includes a kit containing the reagents of this invention.
L'invention concerne un procédé d'amplification d'une séquence d'acide nucléique spécifique ou du complément de celle-ci, à une température relativement constante et sans addition sérielle de réactifs. Ce procédé permet d'obtenir dans un seul milieu de réaction une ARN polymérase, une ADN polymérase, une ribonucléase qui hydrolyse l'ARN de l'hybride d'ARN-ADN sans hydrolyser l'ARN ou l'ADN mono ou bicaténaire, ainsi que des triphosphates de ribonucléoside et de désoxyribonucléoside. Ensuite, on obtient une première matrice d'ARN dans le milieu de réaction, laquelle comprend une séquence complémentaire d'une séquence d'acide nucléique spécifique, des séquences de sens moins destinées à un promoteur et à un site d'initiation qui sont reconnus par l'ARN polymérase, ainsi qu'une séquence terminale 5' complémentaire d'au moins la séquence de sens moins du site d'initiation. Ainsi, la première matrice d'ARN possède une séquence répétée inversée pouvant se replier dans une structure terminale 5' tige-boucle. L'ADN polymérase utilise la première matrice d'ARN pour synthétiser une seconde matrice d'ADN, qui ensemble comprennent un hybride d'ARN-ADN. La seconde matrice d'ADN possède des séquences de sens plus du promoteur et du site d'initiation, ainsi qu'une séquence d'amorçage terminale 3' qui est complémentaire de la séquence de sens plus du site d'initiation. La ribonucléase hydrolyse ensuite un ARN qui comprend l'hybride d'ARN-ADN, permettant ainsi à la séquence d'amorçage terminale 3' de s'hybrider à la séquence de sens plus du site d'initiation dans la seconde matrice d'ADN. L'ADN polymérase utilise ensuite la seconde matrice d'ADN pour synthétiser le promoteur en allongeant la séquence d'amorçage terminale 3' de la seconde matrice d'ADN. L'ADN résultant, partiellement bicaténaire, possède un promoteur orienté vers le sommet d'une structure tige-boucle. L'ARN polymérase reconnaît ensuite le promoteur et transcrit la seconde matrice d'ADN, produisant ainsi des copies de la première matrice d'ARN. Ensuite, on conserve les conditions de réaction du procédé pendant une période suffisante pour mener à bien l'amplification souhaitée de la séquence d'acide nucléique spécifique ou du complément de celle-ci. L'invention concerne également un nécessaire contenant les réactifs de l'invention.
Malek Lawrence T.
Sooknanan Roy R.
Akzo Nobel N.v.
Fetherstonhaugh & Co.
LandOfFree
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