C - Chemistry – Metallurgy – 12 – N
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
N
C12N 9/04 (2006.01) C07H 21/04 (2006.01) C12N 1/21 (2006.01) C12N 15/53 (2006.01)
Patent
CA 2738574
An alcohol dehydrogenase (ADH) from hyperthermophilic archaeon Thermococcus guaymasensis was purified to homogeneity and was found to be a homotetramer with a subunit size of 40 ~ 1 kDa. The gene encoding the enzyme was cloned and sequenced, and found to have significant sequence homology to known zinc-containing ADHs and L-threonine dehydrogenases with both binding motifs of catalytic zinc and NADP+. The wild-type enzyme is a primary-secondary ADH that exhibits a substrate preference for secondary alcohols and corresponding ketones, and exhibits unusual stereoselectivity. The wild-type enzyme was found to have outstanding thermostability, demonstrating 60% activity after incubation at 80°C for 40 hours. Site-directed mutagenesis was used to substitute the cyteine residue at position 56 with a serine, to provide the TgADH(C56S) mutant. In the assays that we carried out, we found virtually no difference in enzyme activity and oxygen-sensitivity between the mutant TgADH (C56S) and wild type TgADH.
L'invention porte sur un alcool déshydrogénase (ADH) provenant de l'archéobactérie hyperthermophile Thermococcus guaymasensis qui a été purifiée jusqu'à l'homogénéité et dont on a trouvé qu'elle était un homotétramère avec une taille de sous-unité de 40 ± 1 kDa. Le gène codant pour l'enzyme a été cloné et séquencé et on a trouvé qu'il avait une homologie de séquence importante par rapport à des ADH contenant du zinc connues et aux L-thréonine déshydrogénases avec des motifs de fixation aussi bien du zinc catalytique que de NADP+. L'enzyme de type sauvage est une ADH primaire-secondaire qui présente une préférence de substrat pour des alcools secondaires et des cétones correspondantes et présente une stéréosélectivité inhabituelle. Il a été trouvé que l'enzyme de type sauvage avait une thermostabilité remarquable, présentant une activité de 60 % après incubation à 80°C pendant 40 heures. On a utilisé la mutagenèse dirigée pour remplacer le résidu de cystéine en position 56 par une sérine, pour produire le mutant TgADH(C56S). Dans les essais que nous avons effectués, nous n'avons trouvé quasiment aucune différence d'activité enzymatique et de sensibilité à l'oxygène entre la TgADH(C56S) mutante et la TgADH de type sauvage.
Ma Kesen
Ying Xiangxian
Borden Ladner Gervais Llp
Ma Kesen
Ying Xiangxian
LandOfFree
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