Trace mrna amplification method and use thereof

Details Trace mrna amplification method and use thereof Trace mrna amplification method and use thereof

C - Chemistry, Metallurgy

12

P

C12P 19/34 (2006.01) C12N 15/09 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01) C40B 50/06 (2006.01)

Patent

CA 2662931

Disclosed is a trace mRNA amplification method which can amplifies a shorter mRNA fragment at good efficiency in the same manner as for a longer mRNA fragment regardless of the length of the nucleotide sequence thereof. Also disclosed is use of the method. The trace mRNA amplification method comprises the following steps: a first step for preparing a mixed solution by adding dummy RNA to a solution containing trace mRNA; a second step for synthesizing antisense DNA by a reverse transcription reaction using the mixed solution as a template; a third step for synthesizing sense DNA complementary to the synthesized antisense DNA to form double-stranded DNA composed of the sense DNA and the antisense DNA; a forth step for ligating a promoter sequence for an RNA polymerase to the 5'-terminus of the sense DNA in the double-stranded DNA to prepare double-stranded DNA for amplification; and a fifth step for amplifying RNA from the double-stranded DNA for amplification by using the RNA polymerase.

L'invention concerne un procédé d'amplification d'ARNm à l'état de trace qui peut amplifier un fragment d'ARNm plus court avec un bon rendement de la même manière que pour un fragment d'ARNm plus long indépendamment de la longueur de la séquence nucléotidique de celui-ci. L'invention concerne également l'utilisation du procédé. Le procédé d'amplification d'ARNm à l'état de trace comprend les étapes suivantes : une première étape de préparation d'une solution mélangée par l'addition d'un ARN factice à une solution contenant un ARNm à l'état de trace ; une seconde étape de synthèse d'un ADN anti-sens par une réaction de transcription inverse à l'aide de la solution mélangée en tant que matrice ; une troisième étape de synthèse de l'ADN sens complémentaire à l'ADN anti-sens synthétisé afin de former un ADN double brin composé de l'ADN sens et de l'ADN anti-sens ; une quatrième étape de ligature d'une séquence promoteur pour une ARN polymérase à l'extrémité 5'-terminale de l'ADN sens dans l'ADN double brin afin de préparer un ADN double brin pour l'amplification ; et une cinquième étape d'amplification de l'ARN à partir de l'ADN double brin pour une amplification à l'aide de l'ARN polymérase.

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