C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/68 (2006.01) C12N 15/10 (2006.01) C12P 19/34 (2006.01)
Patent
CA 2309625
The present invention is directed to a transcription based amplification method for the amplification of DNA targets. With the method of the present invention an isothermal transcription based amplification method is provided for the amplification of double stranded DNA. The method of the present invention for the amplification of double stranded DNA comprises the steps of contacting said double stranded DNA with at least one oligonucleotide comprising a sequence complementary to a part of the first of the two DNA strands comprised in the double stranded DNA, said oligonucleotide further comprising the sequence of a promoter recognized by a RNA polymerase; a further olignucleotide comprising a sequence complementary to a part of the second strand comprised in the double stranded DNA; an enzyme having RNA dependent DNA polymerase activity; an enzyme having DNA dependent DNA polymerase activity; an enzyme having RNase H activity; an enzyme having RNA polymerase activity; and maintaining the thus created reaction mixture under the appropriate conditions for a sufficient amount of time for the amplification to take place. The method according to the invention is particularly useful for amplifying small DNA molecules, e.g. plasmid DNA. Surprisingly, transcription based amplification can start from double stranded DNA, without the need to treat the DNA with restriction enzymes or, what is more important, to separate the strands before hand by applying heat. All reagents conventionally used with isothermal transcription based amplification reactions can simply be used on starting material containing double stranded DNA, as if it where single stranded RNA. With the present invention it has now been found that essentially the same protocols can be used for isothermal transcription based amplification of double stranded DNA. The method is particularly useful for the detection of small DNA molecules of pathogenic microorganisms enabling diagnosis. In particular the circular HIV-1 DNA molecules that are formed during the replication of the HIV-1 virus can be detected by this method. Detection of such circular HIV-1 DNA molecules indicates active replication of the virus, which can be correlated with disease progression, i.e. development of AIDS.
L'invention concerne un procédé d'amplification à base de transcription, utilisé pour l'amplification d'ADN cibles. Le procédé de l'invention comprend un procédé d'amplification à base de transcription isotherme pour l'amplification d'ADN double brin. Ledit procédé d'amplification d'ADN double brin consiste à mettre ledit ADN double brin en contact avec: au moins un oligonucléotide comprenant une séquence complémentaire d'une partie du premier des deux brins d'ADN de l'ADN double brin, ledit oligonucléotide comprenant également la séquence d'un promoteur reconnu par une ARN polymérase; un autre oligonucléotide comprenant une séquence complémentaire d'une partie du deuxième brin de l'ADN double brin; une enzyme ayant une activité d'ADN polymérase dépendant de l'ARN; une enzyme ayant une activité d'ADN polymérase dépendant de l'ADN; une enzyme ayant une activité de RNase H; une enzyme ayant une activité d'ARN polymérase. Il consiste ensuite à maintenir le mélange réactionnel ainsi créé dans des conditions appropriées, pendant suffisamment de temps, pour que l'amplification ait lieu. Le procédé de l'invention est particulièrement utile pour l'amplification de petites molécules d'ADN, telles que l'ADN plasmidique. Etonnamment, l'amplification à base de transcription peut démarrer à partir d'un ADN double brin, sans qu'il soit nécessaire de traiter l'ADN à l'aide d'enzymes de restriction ou, ce qui est plus important, sans qu'il soit nécessaire de séparer les brins au préalable par l'application de chaleur. Tous les réactifs habituellement utilisés dans les réactions d'amplification à base de transcription isotherme peuvent être utilisés simplement sur la matière première contenant l'ADN double brin, comme s'il s'agissait d'un ADN simple brin. Avec le procédé de l'invention, on a découvert que des protocoles sensiblement similaires peuvent être utilisés pour l'amplification à base de transcription isotherme de l'ADN double brin. Ledit procédé est particulièrement utile pour la détection de petites molécules d'ADN de micro-organismes pathogènes permettant le diagnostic. Notamment, les molécules d'ADN circulaires du VIH-1 formées pendant la réplication du VIH-1 peuvent être détectées par ce procédé. La détection desdites molécules d'ADN circulaires du VIH-1 indique la réplication active du virus, qui peut être mise en corrélation avec l'évolution de la maladie, comme par exemple l'évolution du SIDA.
Schukkink Adriana Frederieke
Van Gemen Bob
Van Strijp Dianne Arnoldina Margaretha Wilhelmina
Akzo Nobel N.v.
Fetherstonhaugh & Co.
LandOfFree
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