C - Chemistry – Metallurgy – 12 – N
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
N
C12N 15/89 (2006.01) A01K 67/027 (2006.01) A61K 48/00 (2006.01) C07K 14/47 (2006.01) C12N 5/06 (2006.01) C12N 15/65 (2006.01) C12N 15/86 (2006.01) C12N 15/88 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01) A61K 35/12 (2006.01)
Patent
CA 2350829
Disclosed is a method of obtaining selectable transgenic stem cells of a vertebrate by transfecting a male germ cell with a transfection mixture comprising a nucleic acid construct containing a transcriptional unit of a stem cell-specific promoter, for example, a cyclin A1 promotor, operatively linked to a gene encoding a fluorescent or light-emitting reporter protein. The transfection mixture is a composition for transfection, in vivo or ex vivo, of a vertebrate's male germ cells, which comprises a nucleic acid or transgene, and a gene delivery system, and optionally a protective internalizing agent, such as an endosomal lytic agent, a virus or a viral component, which is internalized by cells along with the transgene and which enhances gene transfer through the cytoplasm to the nucleus of the male germ cell. In stem cells, other than germ cells, grown in vivo, expression of the reporter gene from a cyclin A1 promoter is facilitated by preventing methylation of promoter DNA by the use of flanking insulator elements in the nucleic acid construct. Alternatively, inhibitors of DNA methylation can be used in an in vitro growth medium. A kit contains components of the transfection mixture. Selectable transgenic stem cells have stably integrated the DNA, and non-human transgenic vertebrates comprise these selectable transgenic stem cells.
L'invention concerne une technique qui permet d'obtenir des cellules souches transgéniques sélectionnables d'un vertébré en transfectant une cellule germinale mâle au moyen d'un mélange de transfection. Dans le mélange de transfection, une construction d'acide nucléique contenant une unité transcriptionnelle d'un promoteur spécifique des cellules souches, par exemple un promoteur de la cycline A1, est fonctionnellement liée à un gène codant pour une protéine rapporteur fluorescente ou émettrice de lumière. Le mélange de transfection est une composition permettant de transfecter, in vivo ou ex vivo, des cellules germinales mâles d'un vertébré, qui renferme un acide nucléique ou transgène, un système d'apport de gènes et éventuellement un agent d'internalisation protecteur tel qu'un agent lytique endosomique, un virus ou un composant viral. L'agent d'internalisation est internalisé par les cellules en même temps que le transgène et facilite le transport du gène à travers le cytoplasme jusqu'au noyau de la cellule germinale mâle. Dans les cellules souches autres que les cellules germinales, obtenues in vivo, on peut, pour faciliter l'expression du gène rapporteur à partir d'un promoteur de la cycline A1, empêcher la méthylation de l'ADN promoteur en le flanquant d'éléments isolants dans la construction d'acide nucléique. On peut également utiliser des inhibiteurs de la méthylation de l'ADN dans un milieu de croissance in vitro. L'invention concerne également un kit contenant les composants du mélange de transfection; des cellules souches transgéniques sélectionnables ayant intégré l'ADN d'une manière stable; et des vertébrés transgéniques non humains renfermant lesdites cellules souches transgéniques sélectionnables.
Koeffler H. Phillip
Muller Carsten
Readhead Carol W.
Winston Robert
Cedars-Sinai Medical Center
Gowling Lafleur Henderson Llp
Imperial College Of Science Technology And Medicine
LandOfFree
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