C - Chemistry – Metallurgy – 12 – P
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
P
C12P 19/34 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01)
Patent
CA 2236161
Disclosed are compositions and a method for amplification of and multiplex detection of molecules of interest involving rolling circle replication. The method is useful for simultaneously detecting multiple specific nucleic acids in a sample with high specificity and sensitivity. The method also has an inherently low level of background signal. A preferred form of the method consists of an association operation, an amplification operation, and a detection operation. The association operation involves association of one ore more specially designed probe molecules, either wholly or partly nucleic acid, to target molecules of interest. This operation associates the probe molecules to a target molecule present in a sample. The amplification operation is rolling circle replication of circular nucleic acid molecules, termed amplification target circles, that are either a part of, or hybridized to, the probe molecules. A single round of amplification using rolling circle replication results in a large amplification of the amplification target circles. Following rolling circle replication, the amplified sequences are detected using combinatorial multicolor coding probes that allow separate, simultaneous, and quantitative detection of multiple different amplified target circles representing multiple different target molecules. Since the amplified product is directly proportional to the amount of target sequence present in a sample, quantitative measurements reliably represent the amount of a target sequence in a sample. Major advantages of this method are that a large number of distinct target molecules can be detected simultaneously, and that differences in the amounts of the various target molecules in a sample can be accurately quantified. It is also advantageous that the DNA replication step is isothermal, and that signals are strictly quantitative because the amplification reaction is linear and is catalyzed by a highly processive enzyme.
L'invention concerne des compositions et un procédé d'amplification et de détection multiplex de molécules à analyser, impliquant une réplication selon le modèle du cercle roulant. Le procédé est utile pour la détection simultanée d'acides nucléiques spécifiques multiples dans un échantillon, avec une grande spécificité et une grande sensibilité. Il comprend également un taux fondamentalement faible de signal de fond. Une forme préférée du procédé consiste en une opération d'association, une opération d'amplification et une opération de détection. L'opération d'association implique l'association d'une ou plusieurs molécules de sondage spécialement prévues à cet effet, intégralement ou partiellement de l'acide nucléique, à des molécules cibles à analyser. Cette opération permet d'associer les molécules de sondage à des molécules présentes dans un échantillon. L'opération d'amplification consiste en une réplication selon le modèle du cercle roulant de molécules d'acide nucléique circulaires, appelées cercles cibles d'amplification, qui sont soit une partie des molécules de sondage ou hybridées à celles-ci. Un seul cycle d'amplification utilisant la réplication selon le modèle du cercle roulant permet d'assurer une amplification importante des cercles cibles d'amplification. Après la réplication selon le modèle du cercle roulant, les séquences amplifiées sont détectées au moyen de sondes de codage multicolore et combinatoire qui permettent la détection séparée, simultanée et quantitative de multiples cercles cibles amplifiés différents représentant des multiples molécules cibles différentes. Le produit amplifié est directement proportionnel à l'importance de la séquence cible présente dans un échantillon et les mesures quantitatives représentent donc de manière fiable l'importance de la séquence cible dans un échantillon. Les principaux avantages de ce procédé sont le fait qu'un grand nombre de molécules distinctes peuvent être détectées simultanément et que les différences d'importance entre les diverses molécules cibles peuvent être quantifiées avec précision. L'autre avantage réside dans le fait que la phase de réplication de l'ADN est isothermique, et que les signaux sont strictement quantitatifs car la réaction d'amplification est linéaire et est catalysée par une enzyme de défilement très efficace.
Caplan Michael
Lizardi Paul M.
Smart & Biggar
Yale University
LandOfFree
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