C - Chemistry – Metallurgy – 07 – K
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
07
K
C07K 1/113 (2006.01) C12N 9/64 (2006.01) A61K 38/00 (2006.01)
Patent
CA 2397773
A universal folding method that has been demonstrated to be effective in refolding a variety of very different pro-teins expressed in bacteria as inclusion bodies has been developed. Representative proteins that can be dissolved and refolded in biologically active form, with the native structure, are shown in Table I. The method has two key steps to unfold and then refold the proteins expressed in the inclusion bodies. The first step is to raise the pH of the protein solution in the presence of denaturing agents to pH greater than 9, preferably 10. The protein solution may be maintained at the elevated pH for a period of up to about 24 hours, or the pH immediately decreased slowly, in increments of about 0.2 pH units/24 hours, until the solution reaches a pH of about 8.0, or both steps used. In the preferred embodiment, purified inclusion bodies are dissolved in 8 M urea, 0.1 M Tris, 1 mM glycine, 1 mH EDTA, 10 mM beta-mercaptoethanol, 10 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM redued glutathion (GSH), 0.1 mM oxidized glutathion (GSSG), pH 10. The absorbance at 280 nm (OD280) of the protein solution is 5Ø This solution is rapidly diluted into 20 volumes of 20 mM Tris base. The resulting solution is adjusted to pH 9.0 with 1 M HCl and is kept at 4 C for 24 hrs. The pH is adjusted to pH 8.8 and the solution is kept at 4 C for another 24 hrs. This process is repeated until the pH is adjusted to 8Ø After 24 hrs at pH8.0, the refolded proteins can be concentrated by ultrafiltration and applied to a gel filtration column for purification.
L'invention concerne un procédé de repliement universel qui s'avère efficace pour le repliement d'une variété de protéines très différentes exprimées dans des bactéries en tant que corps d'inclusion. Des protéines représentatives pouvant être dissoutes et repliées dans une forme active sur le plan biologique, avec la structure native, sont représentées à la Table 1. Le procédé comprend deux étapes clefs permettant de déplier et puis de replier les protéines exprimées dans les corps d'inclusion. La première étape consiste à élever le pH de la solution protéique en présence d'agents de dénaturation à un pH supérieur à 9, de préférence à 10. La solution protéique peut être maintenue à un pH élevé pendant un laps de temps allant jusqu'à 24 heures, ou le pH décroît immédiatement de manière lente, à raison d'environ 0,2 unité de pH/24heures, jusqu'au moment où la solution atteint un pH égal environ à 8,0, en variante les deux étapes peuvent être utilisées. Dans un mode de réalisation préféré, des corps d'inclusion purifiés sont dissous dans 8 M urea, 0,1 M Tris, 1 mM glycine, 1 mM EDTA, 10 mM bêta-mercaptoéthanol, 10 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM glutathion (GSH), 0,1 mM glutathion oxydé (GSSG), pH 10. L'absorbance à 280 nm (OD280) de la solution protéique est égale a 5Ø Cette solution se dilue rapidement dans 20 volumes de 20 mM de base Tris. La solution obtenue est ajustée à pH 9.0 avec 1 M HCI et est maintenue à 4 C DEG pendant 24 heures. Le pH est ajusté à pH 8,8 et la solution est maintenue à 4 C DEG pendant encore 24 heures. Ce processus est répété jusqu'à ce que le pH soit ajusté à 8,0. Après 24 heures à pH 8,0, les protéines repliées peuvent être concentrées par ultrafiltration et appliquées à une colonne de filtration de gel en vue d'une purification.
Bereskin & Parr Llp/s.e.n.c.r.l.,s.r.l.
Oklahoma Medical Research Foundation
LandOfFree
Universal procedure for refolding recombinant proteins does not yet have a rating. At this time, there are no reviews or comments for this patent.
If you have personal experience with Universal procedure for refolding recombinant proteins, we encourage you to share that experience with our LandOfFree.com community. Your opinion is very important and Universal procedure for refolding recombinant proteins will most certainly appreciate the feedback.
Profile ID: LFCA-PAI-O-1499200