G - Physics – 01 – N
Patent
G - Physics
01
N
G01N 33/543 (2006.01) A61K 39/395 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01) G01N 33/53 (2006.01) G01N 33/68 (2006.01)
Patent
CA 2470389
A prerequisite of proteomics is the ability to quantify many selected proteins simultaneously. Fluorescent sandwich immunoassays on microarrays hold appeal for such studies, since equipment and antibodies are readily available, and assays are simple, scalable and reproducible. To attain adequate sensitivity and specificity, however, a general method of immunoassay amplification is required. Coupling of isothermal rolling circle amplification (RCA) to universal antibodies can be used for this purpose: RCA on a synthetic DNA circle is initiated by a complementary oligonucleotide attached to an anti- biotin antibody; single-stranded RCA product remains -attached to the antibody, and is detected by hybridization of complementary, fluorescent oligonucleotides. 51 cytokines were measured simultaneously on microarrays with signal amplification by RCA with high specificity, femtomolar sensitivity and 4 log quantitative range. This cytokine microarray was used to measure secretion from human Dendritic cells (DCs) induced by lipopolysaccharide (LPS) or tumor necrosis factor-alpha (TNF-.alpha.). Rapid secretion of inflammatory cytokines such as MIP-1.beta., IL-8, and IP-10 was induced by LPS. Eotaxin-2 and I-309 were found to be induced by LPS, and MDC, TARC, sIL-6R, and sTNF-RI were found to be induced by TNF-.alpha.. Since microarrays can accommodate.sim.1000 sandwich immunoassays of this type, a relatively small number of RCA microarrays appears to offer a tractable approach for proteomic surveys.
L'une des conditions préalables à la protéomie est la capacité de quantifier simultanément un grand nombre de protéines sélectionnées. Les dosages immunologiques sandwiches fluorescents sur des microréseaux sont attrayants pour de telles études, étant donné que l'équipement et les anticorps sont immédiatement disponibles, et les dosages simples, hiérarchisables et reproductibles. Toutefois, pour atteindre une sensibilité et une spécificité adéquates, un procédé général d'amplification de dosage immunologique est nécessaire. A cette fin, il est possible de faire appel au couplage du cercle roulant (RCA) isotherme à des anticorps universels : le RCA sur un cercle d'ADN synthétique est amorcé par un oligonucléotide complémentaire fixé à un anticorps anti-biotine ; le produit de RCA à simple brin reste fixé à l'anticorps, et est détecté par l'hybridation d'oligonucléotides complémentaires fluorescents. 51 cytokines, qui ont été mesurées simultanément sur des microréseaux avec une amplification de signal par le RCA, présentaient une spécificité élevée, une sensibilité femtomolaire et une gamme quantitative de 4 log. Ce microréseau de cytokines a servi à mesurer la sécrétion de cellules dendritiques humaines induite par le lipopolysaccharide (LPS) ou le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-.alpha.). Une sécrétion rapide de cytokines inflammatoires telles que MIP-1.beta., IL-8 et IP-10, a été induite par le LPS. Eotaxine-2 et I-309 se sont avérés être induits par le LPS, et MDC, TARC, sIL-6R et sTNF-RI se sont avérés être induits par le TNF-.alpha.. Etant donné que les microréseaux permettent environ 1000 dosages sandwich de ce type, un nombre relativement réduit de microréseaux RCA s'avère offrir une approche tractable pour les études protéomiques.
Molecular Staging Inc.
Smart & Biggar
LandOfFree
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