C - Chemistry – Metallurgy – 12 – N
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
N
C12N 15/74 (2006.01) C07K 14/315 (2006.01) C12N 15/31 (2006.01) C12N 15/62 (2006.01) C12N 15/65 (2006.01)
Patent
CA 2224172
A novel system for cloning and expression of genes in gram-positive bacteria. The expression system is based on the finding that many gram-positive bacteria sort proteins to their cell surface through cis-acting N-terminal signal sequences and C-terminal anchor regions. In particular, the cell sorting signals of the streptococcal M6 protein, a well-known surface molecule, are used to construct a gram-positive expression system, designated SPEX (Streptococcal Protein Expression). Expression is achieved by cloning the gene of interest into an appropriate SPEX cassette which is then stably introduced into a bacterial host, such as the human commensal Streptococcus gordonii. Depending on the SPEX vector used, recombinant proteins can be anchored to the cell wall prior to release by specific endoproteolytic cleavage or secreted into the culture medium during bacterial growth. The use of host bacteria lacking extracellular proteases should protect secreted proteins from proteolytic degradation. Several expression vectors in this system also produce specifically-tagged recombinant proteins which allows for a one-step purification of the resulting product.
L'invention porte sur un nouveau système de clonage et d'expression de gènes dans des bactéries gram positives. Le système d'expression se base sur le fait que de nombreuses bactéries gram positives effectuent le tri de protéines de la surface des cellules à l'aide de séquences de signalisation N-terminales à activité cis et de régions d'ancrage C-terminales. En particulier les signaux de tri des cellules de la protéine streptococcique M6, molécule superficielle bien connue, servant à construire le système d'expression gram positif SPEX (Streptococcal Protein Expression). L'expression s'obtient par clonage du gène d'intérêt dans une cassette SPEX appropriée qui est ensuite introduite de manière stable dans un hôte bactérien tel qu'un commensal humain du type Streptococcus gordonii. Selon le vecteur SPEX utilisé, il est possible d'ancrer des protéines de recombinaison à la paroi cellulaire avant leur libération par clivage endoprotéolytique spécifique ou sécrétées dans le milieu de culture pendant la croissance des bactéries. Le recours à des bactéries sans protéases extracellulaires devrait protéger les protéines sécrétées de la dégradation protéolytique. Plusieurs vecteurs d'expression du système produisent également des protéines de recombinaison à marquage spécifique permettant la purification en une seule étape du produit résultant.
Darzins Aldis
Fischetti Vincent A.
Hruby Dennis
Whitehead Stephen
Sim & Mcburney
The Rockefeller University
LandOfFree
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Profile ID: LFCA-PAI-O-1961820