C - Chemistry – Metallurgy – 12 – N
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
N
C12N 15/63 (2006.01) C12N 9/12 (2006.01) C12N 15/10 (2006.01)
Patent
CA 2330923
Described are methods and materials which enable rapid, efficient, and scalable cloning of one or more specific target nucleic acid molecules into suitable expression vectors without the need for performing an in vitro ligation step. The invention takes advantage of gap repair mechanisms to produce the desired expression vector(s) in host cells capable of mediating intermolecular homologous recombination. Specific target nucleic acids are cloned by producing expression vector intermediates containing two sequence- specific recombination regions, each of which is substantially homologous to a specific recombination sequence flanking the desired target nucleic acid, through a nucleic acid amplification process using primers which each include a different 5' sequence-specific recombination sequence which lacks complementarity with the base vector and a different 3' priming portion substantially complementary to a primer binding site in the base vector.
On décrit des procédés et des matériels qui permettent un clonage rapide, efficace et échelonnable d'une ou plusieurs molécules d'acides nucléiques cibles spécifiques en vecteurs d'expression appropriés sans nécessité de passer par une étape de ligature in vitro. Le procédé de l'invention met en oeuvre des mécanismes de réparation d'espace vide pour produire les vecteurs d'expression voulus dans des cellules hôtes capables d'induire une recombinaison homologue intermoléculaire. Des acides nucléiques cibles spécifiques sont clonés par production d'intermédiaires de vecteurs d'expression comprenant deux régions de recombinaison spécifique à une séquence, dont chacune est sensiblement homologue à une séquence de recombinaison spécifique flanquant l'acide nucléique cible voulu. Ce clonage s'effectue par un processus d'amplification de l'acide nucléique qui met en oeuvre des amorces incluant chacune une différente séquence de recombinaison spécifique à une séquence 5' dépourvue de complémentarité avec le vecteur de base, et une différente partie d'amorçage d'une séquence 3' sensiblement complémentaire d'un site de liaison de l'amorce dans le vecteur de base.
Perkins Edwards L.
Tugendreich Stuart M.
Gowling Lafleur Henderson Llp
Iconix Pharmaceuticals Inc.
LandOfFree
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