C - Chemistry – Metallurgy – 12 – N
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
N
C12N 15/00 (2006.01) C07K 1/14 (2006.01) C07K 14/62 (2006.01) C12N 15/63 (2006.01) C12N 15/70 (2006.01) C12N 15/73 (2006.01) C12P 21/02 (2006.01)
Patent
CA 2294760
The present invention relates to a vector for expression of a heterologous protein by a Gram negative bacteria, wherein the vector includes a nucleic acid such as DNA encoding the following: an origin of replication region; optionally and preferably a selection marker; a promoter; an initiation region such as translation initiation region and/or a ribosome binding site, at least one restriction site for insertion of heterologous nucleic acid, e.g. DNA, encoding the heterologous protein, and a transcription terminator. The inventive vector may contain DNA encoding the heterologous protein, e.g., pro-insulin such as pro-insulin with a His tag. Additionally, the invention provides a method for extracting a recombinant protein from within a recombinant Gram negative bacteria having a cell membrane, without lysing the bacteria, as well as a method for purifying an isolated recombinant human insulin, wherein the isolated recombinant human pro-insulin is subjected to sulfitolysis, Ni-chelation chromatography, renaturation, limited proteolysis and chromatography separation to provide purified, isolated, recombinant human insulin.
Cette invention a trait à un vecteur servant à l'expression d'une protéine hétérologue par des bactéries gram-négatives. Ce vecteur renferme un acide nucléique tel qu'un ADN codant: une origine de région de réplication, éventuellement et, de préférence, un marqueur de sélection, un promoteur, une région d'amorçage telle qu'une région d'amorçage de traduction génétique et/ou un site d'attachement du ribosome, au moins un site de restriction pour insertion d'un acide nucléique hétérologue, c-à-d d'un ADN, codant la protéine hétérologue et un terminateur de transcription. Le vecteur de l'invention est susceptible de renfermer un ADN codant la protéine hétérologue, c-à-d une pro-insuline telle qu'une pro-insuline pourvue d'une marque His. L'invention concerne, de surcroît, d'une part, une technique d'extraction de protéine de recombinaison de l'intérieur de bactéries gram-négatives de recombinaison possédant une membrane cellulaire et ce, sans action lytique à l'encontre des bactéries et, d'autre part, une technique de purification d'insuline humaine de recombinaison isolée, dans le cadre de laquelle la pro-insuline humaine de recombinaison isolée est soumise à une lyse par sulfite, à une chromatographie par chélation par du nickel, à une renaturation, à une protéolyse limitée ainsi qu'à une séparation par chromatographie et ce, afin de donner lieu à une insuline humaine de recombinaison isolée et purifiée.
Astolfi-Filho Spartaco
de Lima Beatriz Dolabela
de Sousa Heloisa Ribeiro Tunes
Thiemann Josef Ernst
Vilela Luciano
Biobras S.a.
Biomm S.a.
Smart & Biggar
Universidade de Brasilia
LandOfFree
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Profile ID: LFCA-PAI-O-1703102