C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/68 (2006.01) C12Q 1/70 (2006.01)
Patent
CA 2450164
Discloses a novel detection and typing method for viruses, such as human papillomaviruses, based on real-time PCR using self-probing amplicon fluorescent primers. The method comprises: (IA) contacting the sample with a self-probing amplicon ('virus self-probing amplicon') comprising (i) a virus primer capable of hybridising to at least one target viral nucleic acid sequence and undergoing amplification thereof under primer amplification conditions to form a virus primer extension product; (ii) a virus probe comprising a nucleic acid sequence complementary to a target sequence of the virus primer extension product and capable of hybridisation thereto, provided that the self-probing amplicon is adapted to ensure that the virus probe is unresponsive to amplification under the primer amplification conditions; and (iii) a member of a virus signalling system, which system is capable of causing a detectable signal to be effected on hybridisation of the virus probe sequence to the virus primer extension product, whereby presence or absence of the target viral nucleic acid sequence in the sample is indicated by the detectable signal; (IB) amplifying the product of step (IA) under the primer amplification conditions to an extent enabling the detectable signal to be effected after step (II); and (II) separating the virus primer extension product from the target viral nucleic acid sequence; allowing the virus probe to hybridise to the target sequence of the virus primer extension product; and monitoring the signalling system. This method is quick, simple, specific, sensitive, and capable of estimating viral load per cell. The results of over 100 HPV typing reactions performed on cell lines, biopsies and cervical cytobrush samples are given which, when compared to the current reference HPV detection and typing technique, present a kappa value of 0.89. The method is also applicable to other viruses, such as SV40.
L'invention concerne un procédé de détection et de typage de virus (par exemple, types de papillomavirus humain), sous PCR en temps réel, avec amorces fluorescentes à configuration d'amplicon autosondeur, selon les étapes suivantes: (IA) contact entre l'échantillon et l'amplicon ("amplicon autosondeur de virus"), lequel comprend, (i) une amorce de virus capable d'hybridation avec au moins une séquence nucléotidique virale cible et subissant une amplification dans les conditions d'amplification d'amorce pour donner un produit d'extension d'amorce de virus, (ii) une sonde de virus à séquence nucléotidique complémentaire d'une séquence cible du produit d'extension susmentionné et capable d'hybridation avec lui, à condition que l'amplicon autosondeur puisse assurer que la sonde de virus ne réagit pas à l'amplification dans les conditions d'amplification d'amorce, et (iii) un élément du système de signalisation de virus, sachant que le système en question est capable d'engendrer un signal - détectable à l'hybridation de la séquence sonde de virus avec le produit d'extension - et que ce signal indique la présence ou l'absence de la séquence nucléotidique virale cible dans l'échantillon; (IB) amplification du produit issu de (IA), dans les conditions d'amplification d'amorce, jusqu'à permettre l'établissement du signal détectable au-delà de l'étape (II); et (II) séparation du produit d'extension à partir de la séquence nucléotidique virale cible; hybridation de la sonde de virus avec la séquence cible du produit d'extension; et surveillance du système de signalisation. Il s'agit d'un procédé rapide, simple, spécifique, sensible, permettant d'évaluer la charge virale par cellule. Les résultats de plus de 100 réactions de typage de papillomavirus humain sur des lignées cellulaires, des biopsies et des échantillons de frottis vaginal sont fournis: par comparaison avec la technique de référence actuelle pour la détection et le typage du virus considéré, ces résultats présentent une valeur kappa de 0,89. Le procédé est également applicable à d'autres virus, du type virus vacuolant (SV40).
Smart & Biggar
University College Cardiff Consultants Limited
University Of Wales College Of Medicine
LandOfFree
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Profile ID: LFCA-PAI-O-1591540