C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/02 (2006.01) C12N 1/19 (2006.01) C12N 15/10 (2006.01) C12N 15/63 (2006.01) C12N 15/81 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01) G01N 33/68 (2006.01)
Patent
CA 2319147
The present invention provides a genetic method for tethering polypeptides to the yeast cell wall in a form accessible for binding to macromolecules. Combining this method with fluorescence-activated cell sorting provides a means of selecting proteins with increased or decreased affinity for another molecule, altered specificity, or conditional binding. Also provided is a method for genetic fusion of the N terminus of a polypeptide of interest to the C-terminus of the yeast Aga2p cell wall protein. Attaching an scFv antibody fragment to the Aga2p agglutinin effectively mimics the cell surface display of antibodies by B cells in the immune system for affinity maturation in vivo. T cell receptor mutants that are efficiently displayed on the yeast cell surface can be isolated by this method, providing a means of altering T cell receptor binding affinity and specificity by library screening. The selection method also identifies proteins with enhanced phenotypic characteristics, proteins that are displayed at higher levels, proteins that are secreted at higher efficiency and proteins that are more stable.
La présente invention concerne un procédé génétique pour relier des polypeptides à une paroi d'une cellule de levure sous une forme accessible en vue d'une liaison avec des macromolécules. La combinaison de ce procédé avec le triage de cellules par fluorescence permet d'obtenir un moyen de sélection de protéines présentant une affinité accrue ou réduite pour une autre molécule, une spécificité altérée, ou une liaison conditionnelle. L'invention prévoit en outre un procédé de fusion génétique du terminal N d'un polypeptide d'intérêt avec le terminal C d'une protéine de la paroi d'une cellule Aga2p de levure. La liaison entre un fragment anticorps scFv et l'agglutinine de l'Aga2p imite efficacement la présentation de la surface des cellules des anticorps par les cellules B dans le système immunitaire en vue d'une maturation d'affinité in vivo. Les mutants du récepteur de cellule T présentés de manière efficace sur la surface de cellule de levure peuvent être isolés par ce procédé, procurant ainsi un moyen de modifier l'affinité et la spécificité de liaison du récepteur de cellule T par criblage de bibliothèque. Le procédé de sélection permet aussi l'identification des protéines présentant des caractéristiques phénotypiques améliorées, des protéines qui sont présentées à des niveaux supérieurs, des protéines qui sont sécrétées avec plus d'efficacité et des protéines plus stables.
Boder Eric T.
Kieke Michele C.
Kranz David M.
Shusta Eric
Wittrup K. Dane
Mckay-Carey & Company
The Board Of Trustees Of The University Of Illinois
LandOfFree
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Profile ID: LFCA-PAI-O-1733158