C - Chemistry – Metallurgy – 12 – N
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
N
C12N 15/12 (2006.01) C07K 14/47 (2006.01) C12N 9/22 (2006.01) C12N 15/10 (2006.01) C12N 15/11 (2006.01) C12N 15/62 (2006.01) C12N 15/82 (2006.01) C12N 15/90 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01)
Patent
CA 2416664
The present invention relates to DNA binding proteins comprising zinc finger domains in which two histidine and two cysteine residues coordinate a central zinc ion. More particularly, the invention relates to the identification of a context-independent recognition code to design zinc finger domains. This code permits identification of an amino acid for positions -1, 2, 3 and 6 of the .alpha.-helical region of the zinc finger domain from four-base pair nucleotide target sequences. The invention includes zinc finger proteins (ZFPs) designed using this recognition code, nucleic acids encoding these UFPs and methods of using such ZFPs to modulate gene expression, alter genome structure, inhibit viral replication and detect alterations (e.g., nucleotide substitutions, deletions or insertions) in the binding sites for such proteins. In addition, the invention provides a rapid method of assembling a ZFP with three or more zinc finger domains using three sets of 256 oligonucleotides, where each set is designed to target the 256 different 4- base pair targets and allow production of all possible 3-finger ZFPs (i.e., >>106) from a total of 768 oligonucleotides.
La présente invention concerne des protéines de liaison à l'ADN comprenant des domaines en doigt de zinc dans lesquels deux résidus d'histidine et de cystéine coordonnent un ion de zinc central. Plus particulièrement, l'invention concerne l'identification d'un code de reconnaissance indépendant du contexte en vue de créer des domaines en doigt de zinc. Ce code permet l'identification d'un acide aminé pour les positions -1, 2, 3 et 6 de la région .alpha.-hélicale du domaine en doigt de zinc à partir de séquences cibles nucléotidiques à quatre paires de bases. L'invention comprend des protéines en doigt de zinc (ZFP) créées à l'aide de ce code de reconnaissance, des acides nucléiques codant pour ces ZFP et des méthodes d'utilisation de ces ZFP pour moduler l'expression génétique, modifier la structure génomique, inhiber la réplication virale et détecter les modifications (et notamment les substitutions, les suppressions ou les insertions nucléotidiques) dans les sites de liaison pour ces protéines. Par ailleurs, l'invention concerne une méthode permettant d'assembler rapidement ces ZFP avec au moins trois domaines en doigt de zinc au moyen de trois ensembles de 256 oligonucléotides, chaque ensemble étant conçu pour cibler les 256 cibles à quatre paires de bases différentes et pour permettre la production de tous les ZFP à trois doigts possibles (soit plus de 10?6¿) à partir d'un total de 768 oligonucléotides.
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