C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/68 (2006.01) C12M 1/40 (2006.01)
Patent
CA 2170951
A method aimed at the quantification of di- and trinucleotide repeat which includes (a) treating a sample containing the nucleic acids of interest toobtain unpaired nucleotide bases spanning the position of the repeats and flanking regions, if the nucleic acids are not already single stranded; (b) contacting the unpaired nucleotide bases with an oligonucleotide primer capable of hybridizing with a stretch of nucleotide bases present in the nucleic acid ofinterest preferably 3' of the trinucleotide repeats to be quantified, so as to form a duplex between the primer and the nucleic acid of interest; (c) providing means to ensure that the examined nucleic acid and the oligonucleotide primer are confined to a reaction chamber at all further steps; (d) contacting the duplex with a primer extension unit which is capable of base pairing with the first nucleotide base in the core sequence of the repeats, and a template dependent extension enzyme; (e) eliminating non-incorporated primer extension units; (f) contacting the template primer duplex with a primer extension unit which is capable of base pairing with the second nucleotide base in the core sequence of the repeats, and a template dependent extension enzyme; (g) eliminating non-incorporated primer extension units; (h) contacting the template primer hybrid with a primer extension unit which is capable of base pairing with the third nucleotide base in the core sequence of the repeats; a detection moiety containing, primer extension unit which is capable of base pairing with a nucleotide base 5' of the repeats region, said nucleotide base being the first nucleotide base of a type not included among the nucleotide bases in the core sequence of the trinucleotide repeats; and a template dependent extension enzyme; (i) eliminating non-incorporated primer extension units; (j) detecting for the presence of detection moiety containing primer extension unit; (k) steps(d) to (j) are repeated until detecting said detection moiety; (l) the number ofrepeats as stated under (k) enables the determination of the number of trinucleotide repeats, therefore enabling determination of the exact repetition number.
Méthode visant à quantifier les répétitions de di- et trinucléotidiques qui comporte (a) le traitement d'un échantillon contenant les acides nucléiques d'intérêt pour obtenir des bases nucléotidiques non appariées couvrant la position des répétitions et des régions flanquantes, si les acides nucléiques ne sont pas déjà monocaténaires; (b) la mise en contact des bases nucléotidiques non appariées avec une amorce oligonucléotidique capable de s'hybrider avec un segment de bases nucléotidiques présent dans l'acide nucléique d'intérêt, préférablement en 3' des répétitions trinucléotidiques à quantifier, de manière à former un duplex entre l'amorce et l'acide nucléique d'intérêt; (c) la mise en oeuvre de moyens pour s'assurer que l'acide nucléique examiné et l'amorce oligonucléotidique sont confinés dans une enceinte de réaction pour toutes les étapes ultérieures; (d) la mise en contact du duplex avec une séquence d'extension d'amorce capable d'appariement avec la première base nucléotidique dans la séquence principale des répétitions, et une enzyme d'extension dépendante de la matrice; (e) l'élimination des séquences d'extension d'amorce non incorporées; (f) la mise en contact du duplex d'amorce de la matrice avec une séquence d'extension d'amorce capable d'appariement avec la seconde base nucléotidique dans la séquence principale des répétitions, et une enzyme d'extension dépendante de la matrice; (g) l'élimination des séquences d'extension d'amorce non incorporées; (h) la mise en contact de l'hybride d'amorce de la matrice avec une séquence d'extension d'amorce capable d'appariement avec la troisième base nucléotidique dans la séquence principale des répétitions; une séquence d'extension d'amorce contenant une fraction de détection capable d'appariement avec une base nucléotidique en 5' de la région contenant les répétitions, ladite base nucléotidique étant la première base nucléotidique d'un type non inclus parmi les bases nucléotidiques dans la séquence principale des répétitions trinucléotidiques; et une enzyme d'extension dépendante de la matrice; (i) l'élimination des séquences d'extension d'amorce non incorporées; (j) la détection de la présence de la séquence d'extension d'amorce contenant la fraction de détection; (k) la répétition des étapes (d) à (j) jusqu'à la détection de ladite fraction de détection; (l) le nombre de répétitions décelé en vertu de l'étape (k) permet la détermination du nombre de répétitions trinucléotidiques et, par conséquent, du nombre exact de répétitions.
Eyal Nurit
Navot Nir
Bereskin & Parr
Diagenetics Gamidor Ltd.
LandOfFree
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