C - Chemistry – Metallurgy – 12 – N
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
N
C12N 15/10 (2006.01) C12N 15/11 (2006.01) C12N 15/63 (2006.01)
Patent
CA 2386246
A methods for altering expression of a target nucleic acid sequence in a target cell by production of single-stranded cDNA (ss-cDNA) in the target cell in vivo. The target cell is transfected with a cassette comprising a sequence of interest, an inverted tandem repeat, and a primer binding site 3' to the inverted tandem repeat. Transcription of the cassette by the target cell produces an RNA template which is reverse transcribed to produce ss-cDNA of a specified sequence. A reverse transcriptase/RNAse H coding gene may also be transfected into the target cell. The ss-cDNA is modified to remove all flanking vector sequences by taking advantage of the "stem-loop" structure of the ss-cDNA, which forms as a result of the inverted tandem repeat that allows the ss-cDNA to fold back on itself, forming a double stranded DNA stem. The double-stranded stem contains one or more restriction endonuclease recognition sites and the loop, which remains as ssDNA, is comprised of the sequence of interest, which can be any desired nucleotide sequence. This design allows the double-stranded stem of the stem-loop intermediate to be cleaved by the desired corresponding restriction endonuclease(s) and the loop portion, or sequence of interest, is then released as a linearized, single-stranded piece of DNA. This released (or cleaved) ssDNA piece contains minimal, if any, sequence information either upstream 5' or downstream 3' from the double stranded stem. The resulting ssDNA binds to an endogenous target nucleic acid sequence to alter the expression of that sequence for such therapeutic purposes as gene inactivation using duplex or triplex binding of nucleic acids, site-directed mutagenesis, interruption of cellular function by binding to specific cellular proteins, and interfering with RNA splicing functions.
Cette invention se rapporte à des procédés servant à modifier l'expression d'une séquence d'acide nucléique cible dans une cellule in vivo cible par production d'un ADNc monocaténaire dans la cellule cible in vivo. La cellule cible est transfectée avec une cassette comprenant une séquence d'intérêt, une répétition en tandem inversée et un site de liaison d'amorce 3' par rapport à la répétition en tandem inversée. La transcription de la cassette par la cellule cible produit un modèle d'ARN qui est transcrit en mode inverse pour produire l'ADNc monocaténaire d'une séquence spécifiée. Un gène codant la transcriptase inverse/ARNase H peut également être transfecté en cellule cible. L'ADNc monocaténaire est modifié pour éliminer toutes les séquences de vecteurs flanquantes en tirant profit de la structure en tige-boucle de l'ADNc monocaténaire qui se forme comme conséquence de la répétition en tandem inversée permettant à l'ADNc monocaténaire de se replier sur lui-même formant une tige d'ADN bicaténaire. Cette tige bicaténaire contient un ou plusieurs sites de reconnaissance d'endonucléase de restriction, et la boucle, qui reste sous la forme d'ADN monocaténaire, est constituée par la séquence d'intérêt, qui peut être n'importe quelle séquence nucléotidique souhaitée. Cette conception permet à la tige bicaténaire de l'intermédiaire tige-boucle de subir un clivage par la ou les endonucléases de restriction correspondantes souhaitées, et la partie en boucle, ou séquence d'intérêt est ensuite libérée sous la forme d'une partie d'ADN monocaténaire linéarisée. Cette partie d'ADN monocaténaire libérée (ou clivée) contient, le cas échéant, des informations de séquence minimales, soit en amont de la position 5' soit en aval de la position 3' par rapport à la tige bicaténaire. L'ADN monocaténaire qui en résulte se fixe à une séquence d'acide nucléique cible endogène, pour modifier l'expression de cette séquence, à des fins thérapeutiques telles que l'inactivation génétique, utilisant la fixation duplex ou triplex d'acides nucléiques, la mutagénèse dirigée sur site, l'interruption de la fonction cellulaire par fixation à des protéines cellulaires spécifiques et l'interférence avec des fonctions d'épissage d'ARN.
Chen Yin
Conrad Charles A.
Cytogenix Inc.
Smart & Biggar
LandOfFree
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