Methods for amplifying polymeric nucleic acids

Details Methods for amplifying polymeric nucleic acids Methods for amplifying polymeric nucleic acids

C - Chemistry, Metallurgy

12

Q

C12Q 1/68 (2006.01) C07H 21/04 (2006.01) C12P 19/34 (2006.01)

Patent

CA 2533305

The invention provides compositions and methods for amplifying nucleic acid polymer sequences in a high complexity nucleic acid sample. The unique compositions of the invention include a primer set composed of a mixture of two types of primers for DNA synthesis. For extension in one direction, the primers all contain modifications that destroy their ability to serve as templates that can be copied by DNA polymerases. For extension in the opposite direction the set includes at least one primer that can serve as a template and be replicated by DNA polymerases throughout its length. The method can be carried out by mixing the nucleic acid polymer sequence of interest with the set of DNA synthesis primers in an amplification reaction mixture. The reaction mixture is then subjected to temperature cycling analogous to the temperature cycling in PCR reactions. At least one primer in the primer set hybridizes to the nucleic acid polymer. It is preferred that the non- replicable primer hybridizes to the nucleic acid polymer and is extended to produce an extension product that contains sequence from the nucleic acid polymer to which the replicable primer then hybridizes. Of course, if the nucleic acid polymer is double stranded, both the replicable and nonreplicable primers will hybridize and be extended by DNA polymerase.

L'invention concerne des compositions et des procédés d'amplification de séquences d'acide nucléique dans un échantillon d'acide nucléique très complexe. Ces compositions particulières de l'invention comprennent un ensemble d'amorces se composant d'un mélange de deux types d'amorce pour la synthèse de l'ADN. Pour l'extension dans une direction, les amorces contiennent toutes des modifications qui détruisent leur capacité à servir de modèles pouvant être copiés par des ADN polymérases. Pour l'extension dans la direction opposée, l'ensemble comporte au moins une amorce pouvant servir de modèle et peut être répliqué par les ADN polymérases sur leur longueur. Ce procédé peut être mis en oeuvre par le mélange de la séquence d'acide nucléique d'intérêt avec l'ensemble d'amorces de synthèse d'ADN dans un mélange de réaction d'amplification. Le mélange de réaction est ensuite soumis à un cyclage de température analogue au cyclage de température dans les PCR. Au moins une amorce de l'ensemble d'amorces s'hybride à l'acide nucléique. Il est préféré que l'amorce non-réplicable s'hybride à l'acide nucléique et soit étendu pour produire un produit d'extension qui contient une séquence provenant de l'acide nucléique auquel l'amorce réplicable s'hybride ensuite. Bien entendu, si l'acide nucléique est à double brin, les amorces réplicables et non réplicables s'hybrident et sont étendus par l'ADN polymérase.

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