Protein-protein interactions and methods for identifying...

Details Protein-protein interactions and methods for identifying... Protein-protein interactions and methods for identifying...

G - Physics

01

N

G01N 33/68 (2006.01) C07K 14/705 (2006.01)

Patent

CA 2372794

The invention relates to protein-protein interactions and methods for identifying interacting proteins and the amino acid sequence at the site of interaction. Using overlapping hexapeptides that encode for the entire amino acid sequences of the linker domains of human P-glycoprotein gene 1 and 3 (HP- gp1 and HP-gp3), a direct and specific binding between P-gp1 and 3 linker domains and intracellular proteins was demonstrated. Three different stretches (617EKGIYFKLVTM627, 658SRSSLIRKRSTRRSVRGSQA677 and 694PVSFWRIMKLNLT706 for P- gp1 and 618LMKKEGVYFKLVNM631, 648KAATRMAPNGWKSRLFRHSTQKNLKNS674 and 695PVSFLKVLKLNKT677 for P-gp3) in linker domains bound to proteins with apparent molecular masses of .sim.80 kDa, 57 kDa and 30 kDa. The binding of the 57 kDa protein was further characterized. Purification and partial N- terminal amino acid sequencing of the 57 kDa protein showed that it encodes the N-terminal amino acids of alpha and beta-tubulins. The method of the present invention was further validated with Annexin. The present invention thus demonstrates a novel concept whereby the interactions between two proteins are mediated by strings of few amino acids with high and repulsive binding energies, enabling the identification of high-affinity binding sites between any interacting proteins.

Cette invention concerne des interactions protéine-protéine et des techniques permettant d'identifier des protéines interagissant et la séquence d'acides aminés au niveau du site d'interaction. En utilisant des hexapeptides à chevauchements codant pour les séquences d'acides aminées entières des domaines lieurs du gène humain 1 et 3 de P-glycoprotéine (HP-gp1 et HP-gp3), on a démontré une liaison directe et spécifique entre les domaines lieurs de P-gp1 et de P-gp3 et des protéines intracellulaires. Trois séquences différentes (?617¿EKGIYFKLVTM?627¿, ?658¿SRSSLIRKRSTRRSVRGSQA?677¿ et ?694¿PVSFWRIMKLNLT?706¿ pour P-gp1 et ?648¿LMKKEGVYFKLVNM?631¿, ?648¿KAATRMAPNGWKSRLFRHSTQKNLKNS?674¿ et ?695¿PVSFLKVLKLNKT?677¿ pour P-gp3) dans des domaines lieurs se sont liés à des protéines avec des masses moléculaires apparentes de .sim.80 kDa, 57 kDa et 30 kDa. La liaison de la protéine de 57 kDa a fait l'objet d'une analyse plus poussée. Une purification et un séquençage partiel des acides aminé de N-terminal de la protéine de 57 kDa montre qu'elle code pour les acides aminés de N-terminal de tubulines bêta et alpha. La technique de cette invention a aussi été validée avec l'annexine. La présente invention démontre ainsi un nouveau concept par lequel les interactions entre deux protéines sont induites par des chaînes de quelques acides aminés à haute énergie d'interaction négative, permettant d'identifier des sites de liaison à grandes affinités entre n'importe quelles protéines interagissant.

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