C - Chemistry – Metallurgy – 12 – P
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
P
C12P 19/34 (2006.01) C12M 1/40 (2006.01) C12N 15/10 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01)
Patent
CA 2256563
The present invention provides an alternative PCR amplification which does not draw upon the use of thermostable DNA polymerases. It provides means for the controlled manipulation of denaturing conditions which do not demand the use of high denaturing temperature. More particularly, it provides means for the controlled oscillation of divalent metal ions, preferably of divalent metal ions such as Cu2+, Zn2+, Mn2+ and Cd2+, which are known to destabilize the DNA helix and thereby decrease the melting temperature of the DNA helix. The invention also provides methods for the automatization of this process. For instance, by means of cathodic reduction of the divalent metal species the concentration can be decreased to levels that allows for reannealing of separated strands with the primers; while oxidation of deposited metals or oxidation of monovalent metal ions, can restore the initially high concentration that allows for separation of both strands that make up the DNA helix. Electrolytic control of metal ion activity hence provides a tool for the repetitive isothermal denaturation of duplex DNA, and consequently can be used as a substitute for thermal cycling in the amplification of genetic material. Isothermal denaturation of dsDNA may be of considerable importance in the biotechnology and biomedical industry. A key advantage of this method is that it opens perspectives for a wide range of DNA polymerases that can be used with this reaction.
L'invention concerne un autre mode de réalisation de l'amplification en chaîne par polymérase ne mettant pas en application de polymérases d'ADN thermostables. Elle concerne des moyens servant à gérer de façon contrôlée des conditions de dénaturation qui ne nécessitent pas d'utiliser une température de dénaturation élevée. Elle concerne, plus particulièrement, des moyens servant à effectuer l'oscillation contrôlée d'ions métalliques divalents, de préférence, d'ions métalliques divalents, tels que Cu?2+¿, Zn?2+¿, Mn?2+¿ et Cd?2+¿, dont on sait qu'ils déstabilisent l'hélice d'ADN et, de ce fait, augmentent la température de fusion de cette dernière. Elle concerne également des procédés servant à automatiser ce procédé. On peut, par exemple, au moyen de la réduction cathodique d'espèces métalliques divalentes, diminuer la concentration à des niveaux permettant d'hybrider de nouveau des brins séparés avec les amorces, tandis que l'oxydation de dépôts métalliques ou l'oxydation d'ions métalliques monovalents peuvent restituer la concentration initialement élevée permettant de séparer les deux brins constituant l'hélice d'ADN. Le contrôle électrolytique de l'activité des ions métalliques constitue alors un outil de dénaturation isothermique répétitive de l'ADN duplex et on peut, par conséquent, l'utiliser afin de remplacer la répétition thermique dans l'amplification du matériau génétique. La dénaturation isothermique d'ADNds peut présenter une importance considérable pour l'industrie biotechnologique et biomédicale. Un avantage clé de ce procédé réside dans le fait qu'il ouvre des perspectives pour une variété étendue de polymérases d'ADN qu'on peut utiliser avec cette amplification.
Rossau Rudi
Wijnhoven Michael
Innogenetics N.v.
Smart & Biggar
LandOfFree
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