C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/68 (2006.01) C12N 9/00 (2006.01) C12N 15/10 (2006.01) C12N 15/11 (2006.01) C12N 15/63 (2006.01)
Patent
CA 2310510
Two methodologies are provided: the first provides a means for rapidly and efficiently identifying essential and functional genes; and the second provides a means for obtaining biologically active nucleic molecules (ribozymes, EGSs, and antisense) which can be used to inactivate functional genes. In the first method, a library of EGSs is prepared based on all possible known compositions. In a preferred embodiment, the EGSs are twelve or thirteen-mers for targeting bacterial RNAse to cleave a substrate. This library is added to the cells containing the genes to be screened, for example, E. coli. Those cells in which the EGS causes a loss of viability, or other phenotype, are identified. The EGS(s) responsible for the loss of viability are analyzed, and the resulting sequence information used to identify the gene within the known genomic sequences. In the second method, nucleotide molecules with optimal biological activity, for example, directing cleavage of a gene of interest by RNase P, are rapidly identified through the use of a vector including two reporter genes, the first in phase with the gene of interest, and the second as a control to verify that the vector is present in a cell or to aid in selection of cells containing the vector. Those cells where the gene of interest is cleaved by the functional oligonucleotide molecule can then be identified by reference to reporter gene 1. The responsible functional oligonucleotide molecules is then isolated and characterized. These methods provide powerful tools for identifying essential genes whose sequence is known only as part of a genome with unknown function, as well as means for identifying functional oligonucleotide molecules, useful as diagnostic reagents and therapeutics.
L'invention concerne deux méthodologies. Dans la première, un moyen pour identifier rapidement et efficacement des gènes fonctionnels et essentiels est prévu. Dans la deuxième, un moyen pour produire des molécules nucléiques biologiquement actives (ribozymes, séquences guides externes et antisens) qui peuvent être utilisées pour l'inactivation de gènes fonctionnels. Dans le premier procédé, une banque de séquences guides externes (EGS) à base de toutes les compositions possibles connues est préparée. Dans un mode de réalisation préféré, les EGS constituent douze ou treize mères pour cibler l'RNase bactérien pour le clivage d'un substrat. Cette banque est ajoutée à des cellules contenant les gènes à cribler, par exemple, E. coli. Les cellules dans lesquelles EGS provoque une perte de viabilité, ou d'autre phénotype, sont identifiées. La ou les EGS responsables de la perte de viabilité sont analysées, et l'information relative à la séquence résultante est utilisée pour l'identification du gène dans des séquences génomiques connues. Dans le deuxième procédé, les molécules nucléotidiques ayant une activité biologique optimale, par exemple, dirigeant le clivage d'un gène particulier par RNase P, sont rapidement identifiées au moyen d'un vecteur comprenant deux gènes reporters, le premier en phase avec le gène en question et le deuxième permettant de vérifier que le vecteur est présent dans une cellule ou facilitant la sélection de cellules contenant le vecteurs. Les cellules dans lesquelles le gène en question est clivé par la molécule oligonucléotidique fonctionnelle peuvent ensuite être identifiées en fonction du gène reporter 1. Les molécules oligonucléotidiques fonctionnelles responsables sont ensuite isolées et caractérisées. Lesdits procédés constituent des outils puissants pour l'identification de gènes essentiels dont la séquence est connue seulement comme faisant partie intégrante d'un génome à fonction inconnue, ainsi que des moyens d'identification de molécules oligonucléotidiques fonctionnelles, utiles comme réactifs diagnostiques et comme agents thérapeutiques.
Kindt Thomas J.
Nilsen Timothy W.
Robertson Hugh D.
Bereskin & Parr Llp/s.e.n.c.r.l.,s.r.l.
Yale University
LandOfFree
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