C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/48 (2006.01) C09K 11/06 (2006.01) C09K 11/07 (2006.01) C12Q 1/42 (2006.01) G01N 33/50 (2006.01) G01N 33/58 (2006.01)
Patent
CA 2579825
An in vitro protein kinase assay technology that (1) exhibits a high assay signal to background ratio (S/B) and range (S-B); (2) is homogenous; (3) is non-radioactive; and (4) does not require a phospho-specific antibody. Said assay involves complexing a trivalent metal ion (e.g. Ga3+, Fe3+, Al3+, In3+, Ru3+, Sc3+, Y3+) to the surface of amplified luminescent proximity assay acceptor or donor beads, e.g., via a suitable linker such as nitrilotriacetic acid (NTA; also referred to as carboxymethyl-lysine), iminodiacetic acid (IDA), or an appropriately substituted N-containing heterocycle, for example a triazoheterocycle, for example a triazocyclononaneononane, such as 1- propylamino-4-acetato-1,4,7-triazacyclononane. A protein (or constituent part) or other kinase substrate is bound to the surface of the other of an amplified luminescent proximity assay acceptor or donor bead and, if phosphorylated, brought into proximity with the trivalent metal ion-complexed acceptor bead to generate a luminescent signal. Presence of a kinase inhibitor inhibits phosphorylation and therefore signal generation and, in this way, is detectable. As the invention described herein recognizes the presence or absence of phosphate groups on a protein, (or constituent part), or other biological macromolecule (e.g., mono, di, or trinucleotides, cyclic nucleotides or phosphate substituted inositols), it is broadly applicable to any phosphorlylation or dephosphorylation reaction enzymes and provides a highly robust and flexible assay format for protein kinases and other enzyme classes, including lipid kinases, phosphatases, phosphodiesterases and others.
L'invention porte sur la technique d'un bio-essai in vitro de protéines kinases qui: (1) présente un fort rapport signal d'essai/bruit de (S/B) et de distance (S-B); (2) est homogène; (3) n'est pas radioactif; et (4) ne nécessite pas d'anticorps phospho-spécifique et implique le complexage d'un ion métal trivalent (par exemple de Ga3+, Fe3+, Al3+, In3+, Ru3+, Sc3+, Y3+) à la surface de billes acceptrices ou donneuses d'un essai de proximité de luminescence amplifiée, par exemple via un lieur adapté tel que: l'acide nitrilotriacétique (NTA), également dénommé carboxyméthyl-lysine; acide iminodiacétique (IDA), ou un hétérocycle à contenu N correctement substitué par exemple un triazohétérocycle ou un triazocyclononanéononane, tel que le 1-propylamino-4-acétato-1,4,7-triazacyclononane. Une protéine (ou l'une de ses parties) ou un autre substrat de kinase est lié à la surface d'une autre bille réceptrice ou donneuse d'un bio-essai de proximité de luminescence amplifiée, et si elle est phosphorylée, est amenée à proximité de la bille acceptrice complexée à un ion métal trivalent pour produire un signal luminescent. La présence de l'inhibiteur de kinase inhibe la phosphorylation et donc la production de signaux, et devient de ce fait, détectable. Comme l'invention permet de reconnaître la présence ou l'absence de groupes phosphate dans une protéine, (ou ses parties), ou d'autres macromolécules biologiques (par exemple des mono, di, ou trinucléotides, des nucléotides cycliques ou des inositols à substitution phosphate), elle est largement applicable à toute enzyme de réaction de phosphorylation ou de déphosphorylation, tout en constituant un format de bio-essai très robuste et souple pour les protéine kinases et autres classes d'enzymes, dont les kinases lipidiques, les phosphatases, les phosphodiestérases et autres.
Dawes Timothy D.
Kuo Richard C.
Machajewski Timothy D.
Borden Ladner Gervais Llp
Chiron Corporation
Novartis Vaccines And Diagnostics Inc.
LandOfFree
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Profile ID: LFCA-PAI-O-1871702