C - Chemistry – Metallurgy – 12 – N
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
N
C12N 15/10 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01) G01N 33/542 (2006.01)
Patent
CA 2709701
The present invention relates to an in vitro method for detecting protein- protein interactions comprising: (a) expressing in a eukaryotic cell a first fusion protein comprising (i) a (poly)peptide that, when expressed in a cell, accumulates at distinct sites in the nucleus of the cell or interacts with proteinaceous or non- proteinaceous structures accumulated at distinct sites in the nucleus of the cell; and (ii) a (poly)peptide specifically binding to GFP; (b) expressing in the same cell a second fusion protein comprising (i) GFP; and (ii) a bait (poly)peptide; (c) expressing in the same cell a third fusion protein comprising (i) a fluorescent (poly)peptide, the excitation and/or emission wavelength of which differs from that of GFP; and (ii) a prey (poly)peptide; and (d) detecting the fluorescence emission of the fluorescent parts of the second and the third fusion protein in the cell upon excitation, wherein a co-localization of the fluorescence emission of both fusion proteins in the cell nucleus is indicative of an interaction of the bait and the prey (poly)peptide. The invention also relates to an in vitro method for detecting protein-protein interactions comprising: (a) expressing in a eukaryotic cell a first fusion protein comprising (i) a fluorescent (poly)peptide; (ii) a (poly)peptide that, when expressed in a cell, accumulates at distinct sites in the nucleus of the cell; and (iii) a bait (poly)peptide (b) expressing in the same cell a second fusion protein comprising (i) a fluorescent (poly)peptide, the excitation and/or emission wavelength of which differs from that of the fluorescent (poly)peptide comprised in said first fusion protein; and (ii) a prey (poly)peptide and (c) detecting the fluorescence emission of the fluorescent parts of the first and the second fusion protein in the cell upon excitation, wherein a co-localization of the fluorescence emission of both fusion proteins in the cell nucleus is indicative of an interaction of the bait and the prey (poly)peptide. Furthermore, the present invention relates to methods for identifying a compound modulating the interaction of two (poly)peptides and methods of determining the relative strength of the interaction of two proteins with a third protein.
La présente invention concerne une méthode in vitro permettant de détecter des interactions protéine-protéine. La méthode consiste à : (a) exprimer dans une cellule eucaryote une première protéine hybride contenant (i) un (poly)peptide qui, lorsqu'il est exprimé dans une cellule, s'accumule dans des sites distincts du noyau de la cellule ou interagit avec des structures protéiques ou non protéiques accumulées dans des sites distincts du noyau de la cellule ; et (ii) un (poly)peptide se liant spécifiquement à la protéine fluorescente verte (GFP) ; (b) exprimer dans la même cellule une deuxième protéine hybride contenant (i) GFP ; et (ii) une amorce (poly)peptidique ; (c) exprimer dans la même cellule une troisième protéine hybride contenant (i) un (poly)peptide fluorescent, dont la longueur d'onde d'excitation et/ou d'émission diffère de celle de GFP ; et (ii) une proie (poly)peptidique ; et (d) détecter l'émission de fluorescence des parties fluorescentes des deuxième et troisième protéines hybrides dans la cellule lors de l'excitation, une localisation conjointe de l'émission de fluorescence des deux protéines hybrides dans le noyau de la cellule étant révélatrice d'une interaction de l'amorce et de la proie (poly)peptidiques. L'invention concerne également une méthodein vitro permettant de détecter des interactions protéine-protéine, consistant à : (a) exprimer dans une cellule eucaryote une première protéine hybride contenant (i) un (poly)peptide fluorescent ; (ii) un (poly)peptide qui, lorsqu'il est exprimé dans une cellule, s'accumule dans des sites distincts dans le noyau de la cellule ; et (iii) une amorce (poly)peptidique (b) exprimant dans la même cellule une deuxième protéine hybride contenant (i) un (poly)peptide fluorescent, dont la longueur d'onde d'excitation et/ou d'émission diffère de celle du (poly)peptide fluorescent contenu dans ladite première protéine hybride ; et (ii) une proie (poly)peptidique et (c) détecter l'émission de fluorescence des parties fluorescentes des première et deuxième protéines hybrides dans la cellule lors de l'excitation, une localisation conjointe de l'émission de fluorescence des deux protéines hybrides dans le noyau de la cellule étant révélatrice d'une interaction de l'amorce et de la proie (poly)peptidiques. De plus, la présente invention concerne des méthodes d'identification d'un composé modulant l'interaction de deux (poly)peptides ainsi que des méthodes de détermination de la force relative de l'interaction de deux protéines avec une troisième protéine.
Leonhardt Heinrich
Mortusewicz Oliver
Rothbauer Ulrich
Zolghadr Kourosh
Ludwig-Maximilians-Universitaet-Muenchen
Ogilvy Renault Llp/s.e.n.c.r.l.,s.r.l.
LandOfFree
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