Solid phase methods for polynucleotide production

Details Solid phase methods for polynucleotide production Solid phase methods for polynucleotide production

C - Chemistry, Metallurgy

07

H

C07H 21/00 (2006.01) C07H 1/00 (2006.01) C12N 15/10 (2006.01) C12P 19/34 (2006.01)

Patent

CA 2478983

Polynucleotides having in excess of 1,000 nucleotides can be prepared using a solid phase synthesis technique. A feature of the technique is the use of a reusable solid support that contains covalently bound oligonucleotide. This covalently bound oligonucleotide is annealed to a bridge oligonucleotide, where the bridge is also annealed to a first oligonucleotide that forms a portion of the target polynucleotide. After the target polynucleotide is synthesized, it can be removed from the solid support under denaturing conditions, and the solid support re-used to prepare additional target polynucleotides. The yield of the target polynucleotide increases when shearing force is applied to the solid support that is linked to the growing oligonucleotide. This shearing force is thought to extend the growing end of the oligonucleotide away from contact with other oligonucleotide bound to the solid support and make that end more accessible to annealing with solution oligonucleotide. The synthesis is conveniently accomplished on a porous frit, where reagents and washing solutions are pumped through the frit.

L'invention concerne l'utilisation d'une technique de synthèse de phase solide pour préparer des polynucléotides ayant plus de 1 000 nucléotides. Cette technique se caractérise en ce qu'elle utilise un support solide réutilisable qui contient un oligonucléotide lié par covalence. Cet oligonucléotide lié par covalence est fusionné à un oligonucléotide ponté, où le pont est aussi fusionné à un premier oligonucléotide qui forme une partie du polynucléotide cible. Après la synthèse du polynucléotide cible, celui-ci peut être extrait du support solide dans des conditions de dénaturation, et le support solide peut être réutilisé pour préparer des polynucléotides cibles supplémentaires. La production de polynucléotides cibles augmente lorsqu'une force de cisaillement est appliquée au support solide qui est lié à l'oligonucléotide croissant. On pense que cette force de cisaillement étend l'extrémité de croissance de l'oligonucléotide loin du contact avec d'autres liaisons d'oligonucléotides vers le support solide et rend cette extrémité plus accessible à la fusion avec l'oligonucléotide en solution. La synthèse est accomplie de manière appropriée sur un disque fritté poreux, où les agents de réaction et les solutions de lavage sont pompées à travers ledit disque fritté.

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