C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/68 (2006.01) C07H 21/00 (2006.01) C12P 19/34 (2006.01)
Patent
CA 2219891
An oligonucleotide probe is disclosed, the probe including an oligonucleotide, a fluorescer molecule attached to a first end of the oligonucleotide and a quencher molecule attached to the opposite end of the oligonucleotide. The probe is rendered impervious to digestion by the 5'3' exonuclease activity of a polymerase and the 5'3' extension by a polymerase. The invention also includes methods for performing combined PCR amplification and hybridization probing, one such method including the steps of contacting a target nucleic acid sequence with PCR reagents and an oligonucleotide probe as described above, and subjecting these reagents to thermal cycling. One preferred refinement of the above method further includes the addition of a strand displacer to facilitate amplification. Additional similar combined PCR hybridization methods are disclosed, such methods not requiring probes having their 5' ends protected, wherein (i) the polymerase lacks 5'3' exonuclease activity, (ii) a 5'3' exonuclease inhibitor is included, and (iii) an exonuclease deactivation step is performed.
L'invention décrit une sonde oligonucléotidique, laquelle comporte un oligonucléotide, une molécule de composé fluorescent fixée à une première extrémité de l'oligonucléotide et une molécule extinctrice de luminescence fixée à l'extrémité opposée de l'oligonucléotide. On rend la sonde inaccessible à la digestion grâce à l'activité d'exonucléase 5'?3' d'une polymérase et à l'extension 5'?3' par une polymérase. L'invention comprend également des procédés destinés à combiner une amplification par réaction en chaîne de la polymérase ("PCR") et un sondage par hybridation, un tel procédé consistant à mettre en contact une séquence nucléotidique cible avec des réactifs PCR et avec une sonde oligonucléotidique telle que décrite ci-dessus, et à soumettre ces réactifs à un cyclage thermique. Un mode plus élaboré de réalisation préféré du procédé décrit ci-dessus comporte en outre l'ajout d'un déplaceur de brin pour faciliter l'amplification. L'invention décrit des procédés supplémentaires similaires de combinaison d'hybridation et de PCR, lesquels ne nécessitent pas de sondes aux extrémités 5' protégées et dans lesquels (i) la polymérase manque d'activité d'exonucléase 5'?3', (ii) un inhibiteur d'exonucléase 5'?3' est inclus, et (iii) une étape de désactivation de l'exonucléase est réalisée.
Applied Biosystems Llc
Perkin-Elmer Corporation The
Sim & Mcburney
LandOfFree
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Profile ID: LFCA-PAI-O-1959937