Dna polymerase extension assay

Details Dna polymerase extension assay Dna polymerase extension assay

C - Chemistry, Metallurgy

12

Q

C12Q 1/68 (2006.01)

Patent

CA 2222688

An assay for enzymes which act on substrates to produce a single-stranded oligonucleotide product has been developed which involves the DNA polymerase-catalyzed extension of the oligonucleotide cleavage product using labeled nucleotides and a DNA template containing a 3' region complementary to the oligonucleotide product joined to a 5' region consisting of repeated nucleotide residues. The DNA polymerase extension assay does not involve gel electrophoretic separation and is amenable to high volume screening of potential inhibitors. Other key features of the assay are that it monitors the substrate cleavage reaction only at the correct position in the sequence, thereby discriminating against nonspecific cleavage products, and that it is sensitive enough to detect 200 attomoles of product.

On a mis au point une méthode de dosage pour des enzymes qui agissent sur des substrats en produisant un produit oligonucléotidique monocaténaire; la méthode fait intervenir l'allongement, catalysé par une ADN-polymérase, du produit de clivage oligonucléotidique à l'aide de nucléotides marqués et d'une matrice d'ADN contenant une région 3' complémentaire du produit oligonucléotidique reliée à une région 5' constituée de résidus nucléotidiques répétés. La méthode d'allongement à l'ADN polymérase ne comporte pas de séparation par électrophorèse sur gel et permet le criblage à haut volume d'inhibiteurs potentiels. D'autres caractéristiques clés de la méthode sont qu'elle mesure la réaction de clivage du substrat uniquement dans la bonne position dans la séquence, ce qui permet de distinguer les produits de clivage non spécifiques, et qu'elle est suffisamment sensible pour détecter 200 attomoles de produit.

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