C - Chemistry – Metallurgy – 07 – D
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
07
D
C07D 417/04 (2006.01) C07D 403/04 (2006.01) C07D 413/04 (2006.01) C07D 417/14 (2006.01) C07F 9/06 (2006.01) C12N 9/02 (2006.01) C12Q 1/00 (2006.01) G01N 33/53 (2006.01)
Patent
CA 2497560
The present invention provides methods, compositions, substrates, and kits useful for analyzing the metabolic activity in cells, tissue, and animals and for screening test compounds for their effect on cytochrome P450 activity. In particular, a one-step and two-step methods using luminogenic molecules, e.g. luciferin or coelenterazines, that are cytochrome P450 substrates and that are also bioluminescent enzyme, e.g., luciferase, pro-substrates are provided. Upon addition of the luciferin derivative or other luminogenic molecule into a P450 reaction, the P450 enzyme metabolizes the molecule into a bioluminescent enzyme substrate, e.g., luciferin and/or luciferin derivative metabolite, in a P450 reaction. The resulting metabolite(s) serves as a substrate of the bioluminescent enzyme, e.g., luciferase, in a second light~generating reaction. Luminescent cytochrome P450 assays with low background signals and high sensitivity are disclosed and isoform selectivity is demonstrated. The present invention also provides an improved method for performing luciferase reactions which employs added pyrophosphatase to remove inorganic pyrophosphate, a luciferase inhibitor which may be present in the reaction mixture as a contaminant or may be generated during the reaction. The present method further provides a method for stabilizing and prolonging the luminescent signal in a luciferase-based assay using luciferase stabilizing agents such as reversible luciferase inhibitors.
La présente invention concerne des procédés, des compositions, des substrats et des trousses permettant, d'une part, d'analyser l'activité métabolique dans des cellules, des tissus et dans des animaux et, d'autre part, de cribler des composés d'essais pour rechercher leur effet sur l'activité du cytochrome P450. Plus particulièrement, cette invention concerne des procédés en une ou deux étapes qui consistent à utiliser des molécules luminogènes, par exemple, des luciférines ou coélentérazines, qui sont des substrats du cytochrome P450 et qui sont également des substrats d'une enzyme bioluminescente, par exemple, la luciférase. A l'adjonction du dérivé de la luciférine ou d'une autre molécule luminogène dans une réaction du P450, l'enzyme P450 métabolise la molécule en un substrat d'enzyme bioluminescent, par exemple, un métabolite de luciférine et/ou du dérivé de luciférine, dans une réaction du P450. Le ou les métabolites ainsi obtenus sont utilisés en tant que substrat de l'enzyme bioluminescent, par exemple, la luciférase, dans une seconde réaction génératrice de lumière. La présente invention concerne également des dosages biologiques luminescents du cytochrome P450 à faibles signaux de fond et à haute sensibilité. On démontre également la sélectivité de l'isoforme. La présente invention concerne également un procédé amélioré permettant de réaliser des réactions de luciférases au moyen de pyrophosphatase ajoutée pour éliminer le pyrophosphate inorganique, un inhibiteur de luciférase pouvant être contenu dans le mélange de réaction en tant que contaminant ou pouvant être généré pendant la réaction. Cette invention concerne également un procédé consistant à stabiliser et à prolonger le signal luminescent dans un dosage biologique à base de luciférase, au moyen d'agents stabilisateurs de luciférase, tels que des inhibiteurs du luciférase réversibles.
Cali James J.
Daily William
Frackman Susan
Hawkins Erika
Ho Samuel Kin Sang
Mbm Intellectual Property Law Llp
Promega Corporation
LandOfFree
Luminescence-based methods and probes for measuring... does not yet have a rating. At this time, there are no reviews or comments for this patent.
If you have personal experience with Luminescence-based methods and probes for measuring..., we encourage you to share that experience with our LandOfFree.com community. Your opinion is very important and Luminescence-based methods and probes for measuring... will most certainly appreciate the feedback.
Profile ID: LFCA-PAI-O-1804266