C - Chemistry – Metallurgy – 12 – N
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
N
C12N 15/57 (2006.01) C07K 16/40 (2006.01) C12N 5/10 (2006.01) C12N 9/64 (2006.01) C12N 15/62 (2006.01) C12N 15/85 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01) G01N 33/573 (2006.01)
Patent
CA 2371783
In this paper, we describe RT-PCR strategies that allowed us to identify and clone members of the NEP-like family. Degenerate oligoncleotide primers corresponding to consensus sequences located on either side of the HEXXH consensus sequence for zincins were designed and used in RT-PCR with mouse and human testis cDNAs. DNA with lengths expected from the sequence of this class of enzympes were obtained. These DNA fragments were cloned and sequenced. Using this PCR strategy and the PCR fragments as probes to screen cDNA libraries, three zincin-like peptidases were identified in addition of known members of the family. The cDNA sequences allowed to derive specific probes for Northern and in situ hybridization, and probe human chromosomes to localize the gene and establish potential links to genetic diseases. Furthermore, these cDNA sequences were used to produce recombinant fusion proteins in Escherichia coli is order to raise specific antibodies. Finally, the cDNA sequences were cloned in mammalian expression vectors and transfected in various mammalian cell lines to produce active recombinant enzymes suitable for testing specific inhibitors. Image
L'invention concerne des stratégies de RT-PCR permettant l'identification et le clonage de membres de la famille apparentée à la néprilysine. On a conçu et utilisé des amorces oligonucléotidiques dégénérées correspondant à des séquences consensus situées d'un côté ou de l'autre de la séquence consensus HEXXH pour les zincines, dans la RT-PCR avec des ADNc de testicules de souris et d'humains. On a obtenus des fragments d'ADN présentant les longueurs prévues d'une séquence de cette classe d'enzymes. On a cloné et séquencé ces fragments d'ADN. On a identifié trois peptidases apparentées à la zincine, outre les membres connus de la famille, en utilisant cette stratégie PCR et les fragments de PCR en tant que sondes pour le criblages des banques d'ADNc. Les séquences d'ADNc nous ont permis de dériver des sondes spécifiques pour l'hybridation de Northern et in situ, ainsi que de sonder des chromosomes humains pour localiser le gène et établir des liens potentiels avec des maladies génétiques. Par ailleurs, on a utilisé ces séquences d'ADNc pour produire des protéines de fusions recombinées dans Escherichia coli afin d'obtenir des anticorps spécifiques. Pour finir, on a cloné les séquences d'ADNc dans des vecteurs d'expression mammaliens et on les a transfectées dans diverses lignées cellulaires mammaliennes pour produire des enzymes recombinées actives appropriées à l'analyse d'inhibiteurs spécifiques.
Boileau Guy
Desgroseillers Luc
Goudreau Gage Dubuc
Universite de Montreal
LandOfFree
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