C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/68 (2006.01)
Patent
CA 2123680
2123680 9310257 PCTABS00162 La présente invention a pour objet un procédé de détermination de la quantité d'un fragment d'ADN d'intérêt dans un échantillon à analyser par une méthode d'amplification enzymatique in vitro dudit fragment, caractérisé en ce que: 1) on ajoute à l'échantillon à analyser contenant le fragment d'ADN d'intérêt, un fragment d'ADN standard différent du fragment d'ADN d'intérêt mais amplifiable par les mêmes oligonucléotides amorces, les fragments d'ADN standards et d'intérêt ne différant en séquence et/ou en taille de pas plus de 10 % de préférence pas plus de 5 nucléotides par brin, 2) on co-amplifie les fragments d'ADN d'intérêt et standard avec les mêmes amorces, de préférence jusqu'à saturation de l'amplification du fragment d'ADN d'intérêt, 3) on ajoute dans le milieu réactionnel obtenu à l'étape 2): soit deux types d'oligonucléotides marqués sondes spécifiques, chacun respectivement des fragments d'ADN d'intérêt et standards et différents des oligonucléotides amorces d'amplification de l'étape 2), soit un ou plusieurs oligonucléotide(s) amorce(s) marqué(s), spécifique(s) aux fragments d'ADN d'intérêt et standards, et différents des amorces de l'étape 2), et on effectue un ou quelques cycle(s) d'amplification supplémentaire(s) avec la ou lesdites amorce(s), de sorte que, après dénaturation de l'ADN, la ou lesdites amorce(s) s'hybride(nt) avec lesdits fragments en un site approprié pour qu'une élongation par l'ADN polymérase génère des fragments d'ADN marqués de tailles et/ou de séquences différentes ou avec des marqueurs différents selon qu'ils proviennent des fragments d'ADN d'intérêt ou standards respectivement, puis 4) on détermine la quantité initiale de fragment d'ADN d'intérêt comme étant le produit de la quantité initiale de fragment d'ADN standard et du rapport entre la quantité de fragment d'ADN d'intérêt amplifié et la quantité de fragment d'ADN standard amplifié, rapport qui est identique à celui des quantités des fragments d'ADN marqués provenant respectivement des fragments d'ADN d'intérêt et standards amplifiés obtenus à l'étape 3).
Cochet Madeleine
Darche Sylvie
Kourilsky Philippe
Pannetier Christophe
Institut National de La Sante Et de La Recherche Medicale (inser
Institut Pasteur
Swabey Ogilvy Renault
LandOfFree
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Profile ID: LFCA-PAI-O-2063669